Relación de las proteínas Wsc1p y Rgf1p en la biosíntesis de la pared celular de  Schizosaccharomyces pombe

Sandra Margarita Cruz Quintana; Pedro Díaz Sjostrom; Michel Leiva Mora; Oscar Patricio Núñez Torres

Relación de las proteínas Wsc1p y Rgf1p en la biosíntesis de la pared celular de Schizosaccharomyces pombe

Artículo original

Relación de las proteínas Wsc1p y Rgf1p en la biosíntesis de la pared celular de Schizosaccharomyces pombe

Relationship of the Wsc1p and Rgf1p Proteins in the Biosynthesis of the Cell Wall of Schizosaccharomyces pombe

Sandra Margarita Cruz Quintana¹
Pedro Díaz Sjostrom¹
Michel Leiva Mora¹
Oscar Patricio Núñez Torres¹

¹Universidad Técnica de Ambato. Tungurahua, Ecuador.

RESUMEN

Introducción: La pared celular fúngica es una estructura esencial para el mantenimiento de la morfología y protege a las células frente a las condiciones adversas del medio externo, por lo que su conocimiento es importante para identificar dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos. Wsc1p se ha caracterizado como posible sensor de los daños de la pared celular de Schizosaccharomyces pombe y Rgf1p es uno de los activadores de la GTPasa Rho1p, que integra la cascada de señalización de integridad celular.
Objetivo: Identificar la relación de las proteínas WSC1p y Rgf1p en la biosíntesis de la pared celular de Schizosaccharomyces pombe.
Métodos: Se emplearon técnicas de clonación molecular, métodos genéticos, técnicas de microscopía, Western Blot, determinación de la actividad de Pmk1p bajo condiciones de estrés y análisis informático de las secuencias de ADN y proteínas.
Resultados: Las proteínas Wsc1p y Rgf1p colocalizan en el septo y los polos, la deleción simultánea de los genes wsc1⁺ y rgf1⁺ es letal; sin embargo, la sobreexpresión de Rgf1p no es letal en el mutante wsc1Δ, además la sobreexpresión de wsc1⁺ aumenta los niveles de fosforilación de Pmk1p, a través del módulo de MAP kinasas y depende parcialmente de Rgf1p.
Conclusiones: La sobreexpresión de Wsc1p aumenta la cantidad de pared celular, lo que es un estrés para la célula y podría actuar activando la cascada de integridad celular, parcialmente, a través de Rgf1p.

Palabras clave: pared celular; sensor; biosíntesis; cascada de señalización; integridad celular; Wsc1p; Rgf1p.

ABSTRACT

Introduction: The fungal cell wall is a structure essential for the maintenance of morphology. It protects cells against adverse conditions provoked by the external environment, a reason why possessing knowledge about it is important to identify targets for the development of new antifungal agents. Wsc1p has been characterized as a possible sensor for cell wall damage in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, while Rgf1p is one of the activators of the GTPase Rho1p, which integrates the cell integrity signaling cascade.
Objective: To identify the relationship of the WSC1p and Rgf1p proteins with the biosynthesis in the cell wall of Schizosaccharomyces pombe.
Methods: Molecular cloning techniques, genetic methods, microscopy techniques, Western Blot, determination of Pmk1p activity under stress conditions, as well as computer analysis of DNA and protein sequences were used.
Results: The Wsc1p and Rgf1p proteins are colocalized in the septum and the poles. Simultaneous deletion of the wsc1⁺ and rgf1⁺ genes is lethal. However, the overexpression of Rgf1p is not lethal in the wsc1Δ mutant; in addition, the overexpression of wsc1⁺ increases the levels of phosphorylation of Pmk1p, through the MAP kinase module, and depends only partially on Rgf1p.
Conclusions: The overexpression of Wsc1p increases the amount of cell wall, which is a stress for the cell and could act by activating the cell integrity cascade, partially, through Rgf1p.

Keywords: cell wall; sensor; biosynthesis; signaling cascade; cell integrity; Wsc1p; Rgf1p.

Recibido: 27/03/2020
Aceptado: 24/09/2020

INTRODUCCIÓN

La pared celular fúngica es una estructura clave para resistir las adversidades ambientales y es una diana potencial para los agentes antifúngicos. En los hongos la señalización celular y la plasticidad de la pared celular son cruciales para mantener los procesos fisiológicos. Las proteínas sensoras del daño en la pared celular fúngica se localizan en la membrana plasmática y desencadenan complejas cascadas de señalización que llevan a la regulación transcripcional dentro de los núcleos.⁽¹⁾

Se han descrito cinco sensores de integridad de la pared celular (Wsc1, Wsc2, Wsc3, Mid2 y Mtl1) en Saccharomyces cereviciae, que detectan el daño e interaccionan con Rom2p, que es un componente de la ruta de señalización de integridad celular.^(2,3) Entre Wsc1p de S. pombe y Wsc1p de S. cerevisiae el porcentaje de aminoácidos idénticos es del 30 % y al analizar los aminoácidos conservados o con funciones similares, este porcentaje aumenta hasta un 48 %.⁽⁴⁾

La ORF (marco de lectura abierto), correspondiente al gen wsc1⁺, consta de 1125 pb, y codifica una proteína de 374 aminoácidos (aa') con un peso molecular aproximado de 38,3 kDa y se encuentra en el cromosoma II. Esta proteína presenta un dominio extracitoplásmico (1-292 aa') y posee una secuencia correspondiente a un péptido señal (1-20 aa'). Además, presenta un motivo con 8 cisteínas, llamado también dominio Wsc o dominio rico en cisteínas (CRD) (34-109 aa'), que forma una estructura al final de la barra de serinas y treoninas y que podría "sentir" señales y modular la actividad de la proteína.⁽⁵⁾La secuencia continúa con un dominio rico en residuos de serina y treonina (STR) que podría estar fuertemente glicosilado, y un dominio transmembrana (293-315 aa'). La cola citoplásmica (316-374 aa') se caracteriza por la presencia de aminoácidos cargados negativamente (5 de ácido aspártico).⁽⁶⁾

En S. pombe, Rho1p es una GTPasa homóloga de RhoAp humana y tiene varias funciones, como la de regular la integridad celular y crecimiento polarizado. La actividad de Rho1p está regulada por tres GEF (factor intercambiador de nucleótido de guanina), Rgf1p, Rgf2p y Rgf3p, que catalizan el intercambio de GDP a GTP, lo que hace que la GTPasa se encuentre en estado activo. Rgf1p específicamente participa en la síntesis de la pared celular, citoesqueleto de actina e integridad celular, es el único GEF de Rho1p conocido que es componente de la cascada de integridad en S. pombe.^(7,8)

La ORF correspondiente al gen rgf1⁺ consta de 4 Kb y codifica una proteína de 1334 aminoácidos (aa') con un peso molecular estimado de 150.1 kDa. El análisis detallado de la secuencia proteica revela la presencia de cuatro dominios altamente conservados, un dominio DEP (Dishevelled, Egl-10 y Pleckstrin, aa' 424-497), un dominio DH (Dbl homology), también llamado RhoGEF (aa' 469-653), un dominio PH (Plekstrin Homology, aa' 693-855) y un dominio CNH (Citron Kinase Homology, aa' 935-1239). El dominio RhoGEF se encuentra presente en todas las proteínas con función intercambiadora de nucleótidos de guanina, para GTPasas de la familia Rho. Los datos bioquímicos disponibles hasta el momento proponen que el dominio DH es el responsable de la unión y activación de las GTPasas, mientras que el dominio PH podría intervenir en la localización subcelular de las proteínas y en la regulación de la actividad del dominio DH. La función de los dominios DEP y CNH no está clara, pero en muchos casos actúan como dominios reguladores relacionados con interacciones macromoleculares.⁽⁹⁾

Schizosaccharomyces pombe es un modelo atractivo para estudiar la morfogénesis celular; esta levadura tiene forma cilíndrica, crece de forma asimétrica polarizada por la extensión de los extremos y se divide por fisión binaria. La forma de la célula de S. pombe está determinada por el citoesqueleto de actina, los microtúbulos y la pared celular.⁽¹⁰⁾

Los principales componentes estructurales de la pared celular de S. pombe son β(1,3)-d-glucano y β(1,6)-glucano (46 % al 54 %), los α(1,3)-d-glucanos (18 % a 28 %) y galactomanano (9 % a 14 %).⁽¹¹⁾La pared celular debe estar conectada al anillo de actomiosina a través de la membrana plasmática, y esto probablemente involucre una o varias proteínas de membrana capaces de conectar el espacio periplásmico con el citoplasma.⁽¹²⁾

Tanto Wsc1p como Rgf1p intervienen en la biosíntesis de la pared celular de S. pombe, por lo que el propósito de la investigación es identificar la relación entre las proteínas WSC1p y Rgf1p en la biosíntesis de la pared celular de Schizosaccharomyces pombe.

MÉTODOS

Para determinar la relación existente entre las proteínas Wsc1p y Rgf1p se realizó una investigación experimental, donde el microrganismo que se utilizó, mayoritariamente, fue la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Para realizar los trabajos de clonación molecular se utilizaron también diferentes cepas de Escherichia coli como DH5a (Life Technologies) y CJ236 (BioRad). Los medios de cultivo utilizados para el crecimiento y mantenimiento de S. pombe son los descritos por Moreno,⁽¹³⁾ medio rico (YES), medio mínimo (EMM o MM) y medio de esporulación (MEA). Para el cultivo de E. coli se utilizaron los medios LB (Luria-Bertani) y 2xYT.

Para determinar la localización subcelular de Wsc1p y Rgf1p se fusionó la secuencia codificante de la proteína verde fluorescente (GFP) en Wsc1p y rojo Tomato en Rgf1p, justo antes del codón de parada de la secuencia del gen. Esta construcción se integró en el genoma de los mutantes wsc1Δ y rgf1Δ, respectivamente, y bajo el control de su propio promotor, de esta forma la totalidad de las proteínas está marcada con los fluorocromos y se pudo visualizar en un microscopio de fluorescencia.

Se realizó una búsqueda con la secuencia "ScWsc1p" en la base de datos de Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisión); por homología se consideró para el presente estudio SPBC30B4.01c por tener una disposición de dominios similar a la de los sensores descritos en S. cerevisiae.

Construcción de los mutantes nulos

Para eliminar la ORF correspondiente al gen wsc1⁺ se utilizó la técnica de remplazamiento génico en un solo paso descrita por Rothstein,⁽¹⁴⁾ para lo que se construyó un casete de deleción con un marcador de selección. Mientras que la ORF del gen rgf1⁺se eliminó en dos pasos; se obtuvieron primero las regiones flanqueantes (3' y 5') por PCR (polymerase chain reaction).

Construcción y manipulación de plásmidos

Se construyó un plásmido que lleva la fase de lectura abierta del gen wsc1⁺ bajo el control del promotor nmt1 (pREP3x-wsc1⁺). De forma similar también se construyó el plásmido pREP3x-rgf1⁺para sobreexpresar las proteínas Wsc1p y Rgf1p.

Purificación y detección de Pmk1p-HA6H activado

Se utilizaron células de la cepa silvestre y de los mutantes con la copia genómica de pmk1⁺ marcadas en su extremo 3' con HA y 6 histidinas (HA6His).⁽¹⁵⁾ La proteína Pmk1p se purificó mediante bolas de Ni²⁺ que presentan afinidad por las 6His, posteriormente se analizó la fracción de Pmk1p fosforilada mediante SDS-PAGE y Western Blot, para lo que se utilizaron anticuerpos policlonales anti-fosfo-p44/42 que detectan el estado activo de Pmk1p. Los niveles totales de Pmk1p se detectaron a partir de los extractos celulares mediante SDS-PAGE y Western Blot, con el uso de anticuerpos anti-HA.

Microscopía y análisis de imágenes

Para realizar estas técnicas se empleó un microscopio Leica DM RXA, equipado con sistema de iluminación halógena y equipo de fotografía digital. Además, se utilizó el equipo Personal Deltavision Microscope (Applied Precision), que consta de un microscopio invertido Plympus IX-70. Se observaron las muestras por microscopía de contraste de fases y contraste interferencial (Nomarski), microscopía de fluorescencia directa con GFP (proteína verde fluorescente) y tinción con Calcoflúor.

Análisis bioinformático de los datos

Para el análisis informático de las secuencias de ADN y de aminoácidos, alineamientos de secuencias y mapas de restricción se utilizaron los programas DNASTARTM y DNASTRIDER. Las secuencias génicas y proteicas se obtuvieron de las bases de datos de S. pombe y de The Wellcome Trust Sanger Institute Schizosaccharomyces pombe Gene DB, disponible en http://www.genedb.org/genedb/pombe/

RESULTADOS

Localización de Wsc1p y Rgf1p

Tanto Wsc1p-GFP como Rgf1p-Tomato, colocalizan en los polos y en el septo, coincidiendo con los sitios de crecimiento activo de la célula (Fig. 1).

Localización de Rgf1p-GFP en el mutante wsc1Δ

Para estudiar la localización de Rgf1p en el mutante wsc1D se construyó una cepa wsc1Δ rgf1Δ, en la que la copia silvestre de la proteína Rgf1p está marcada con GFP e integrada en el locus leu. Se observa que en el mutante wsc1Δ rgf1Δ Rgf1p-GFP, Rgf1p se localiza normalmente en los polos y en el septo de la misma forma que lo hace en la cepa silvestre (Fig. 2).

La deleción simultánea de los genes wsc1 ⁺y rgf1⁺ es letal

Para analizar la relación funcional entre wsc1⁺ y rgf1⁺ se estudió el fenotipo de cepas delecionadas en cada uno de los genes. De ese modo cuando se intentó obtener la combinación, rgf1Δwsc1Δ, no se obtuvo ningún mutante doble, ni al analizar las esporas al azar, ni mediante micromanipulación y posterior análisis de tétradas, lo que indica que son inviables.

Estos resultados fueron confirmados al observar el fenotipo de las cepas que se construyeron a tal efecto y se denominan "apagados":P81nmt1-rgf1wsc1Δ, que lleva la deleción de wsc1 ⁺,y la única copia de rgf1⁺ existente en la célula se encuentra bajo el control de un promotor P81nmt1, reprimible por tiamina. Las células crecen perfectamente en ausencia de tiamina (promotor encendido), pero son incapaces de crecer en presencia de tiamina (promotor apagado) (Fig. 3). Cuando las células creciendo en fase logarítmica (sin tiamina) se "apagan", es decir, se añade tiamina al medio de cultivo, aproximadamente el 95 % de las células, se lisan con forma alargada, un fenotipo característico del mutante rgf1Δ.

La sobreexpresión de Rgf1p no es letal en el mutante wsc1Δ

Los datos de los apartados anteriores indican que Wsc1p podría estar involucrada en el anclaje adecuado de Rgf1p a la membrana y en su activación, pero no aclaran si Rgf1p regula la integridad celular en paralelo o por debajo de Wsc1p. Para distinguir entre estas dos posibilidades, el gen rgf1⁺fue sobreexpresado en un plásmido pPGR33 (pREP3x-rgf1⁺) en la cepa silvestre y en el mutante wsc1Δ.

Como se muestra en la figura 4-A las células wsc1Δ son prácticamente "insensibles" a la sobreexpresión de rgf1 ⁺ (pREP3x-rgf1⁺), y forman colonias en condiciones de desrepresión, mientras que la cepa silvestre no crece en estas condiciones. Se inocularon diluciones seriadas de las cepas wt, mtl2Δ (YS1220) otro posible sensor y wsc1Δ (GRG15) transformadas con el plásmido pREP3X-rgf1⁺ y de la cepa wt con el plásmido pREP3X (vacío), en placas de MM sin tiamina y de YES, y se incubaron 3 días a 28 ºC.

Cuando se sobreexpresa rgf1⁺ en el mutante wsc1Δ no se observan células de gran tamaño ni acumulaciones asimétricas de material de pared celular (que se tiñen con Calcoflúor), tal y como aparecen en la cepa silvestre transformada con el plásmido (pREP3x-rgf1⁺) (Fig. 4-B). De acuerdo con esto, la morfología de las células que sobreexpresan rgf1⁺ en el mutante wsc1Δ fue muy parecida a la de las células de la cepa silvestre transformadas con el plásmido vacío (pREP3X).

La sobreexpresión de wsc1⁺ aumenta los niveles de fosforilación de Pmk1p, dependiendo solo parcialmente de Rgf1p

La sobreexpresión de wsc1⁺ aumenta claramente los niveles de fosforilación de Pmk1p, comparado con la cepa que lleva el plásmido vacío. Este aumento depende del módulo de MAP kinasas ya que no se produce en el mutante mhk1Δ un componente de la cascada, y depende solo parcialmente de Rgf1p (Fig. 5). En la parte izquierda se muestra Pmk1p obtenida a partir de células de la cepa silvestre pmk1⁺-HA6His (MI200) transformada con los plásmidos pREP3X (vacío) y pREP3X-wsc1⁺, desreprimidas en MM sin tiamina durante 22 horas. En la parte derecha, las células de la cepa mkh1Δ pmk1⁺-HA6His (PG318) y rgf1Δ pmk1⁺-HA6His (PG285) fueron transformadas con los plásmidos pREP41X vacío y pREP3X- wsc1⁺.

DISCUSIÓN

En S. pombe el crecimiento tiene lugar de forma polarizada y la síntesis de la pared celular se da preferentemente en la zona de los polos durante el crecimiento vegetativo y en el septo durante la división celular. De acuerdo con esto, las proteínas que intervienen en este proceso se localizan en estos lugares.⁽¹⁶⁾

Como se pudo comprobar ambas proteínas se localizan en los polos y está descrita su relación con el crecimiento polarizado en S. pombe. Wsc1p se localiza casi exclusivamente en el polo que crece en el mutante tea4Δ (Tea4p es un marcador de polaridad) mientras que se sitúa en ambos polos en la cepa silvestre.⁽⁴⁾ Rgf1p también se localiza en los polos cuando estos se encuentran en crecimiento por lo que en su ausencia hay defectos en el crecimiento bipolar de S. pombe.⁽⁷⁾ Estos resultados sugieren que Wsc1p y Rgf1p podría formar parte de complejos con otras proteínas en las zonas de crecimiento activo de la célula.

La sobreexpresión de Rgf1p es letal en la cepa silvestre y aumenta casi el doble la cantidad de b-glucano y de a-glucano de la pared celular. Si Rgf1p está regulada de algún modo por Wsc1p o, dicho de otro modo, si la actividad de Rgf1p estuviera comprometida por la función de Wsc1p, cabría esperar que las células del mutantewsc1D fueran "resistentes" a la sobreexpresión de rgf1⁺. Por otra parte, si Rgf1p y Wsc1p regulan la integridad celular en forma paralela, nmt1-rgf1⁺ debe ser tan tóxica en células wsc1Δ como en las células de la cepa silvestre o podría ser aún más tóxica.⁽⁷⁾

Una explicación posible, aunque no la única, es que Wsc1p sea necesario para la activación de Rgf1p al menos en condiciones de estrés (como ocurre al sobreexpresar Rgf1p); en este sentido la reducción de material de pared celular (probablemente b-glucano) podría explicar por qué el mutante wsc1Δ es tolerante a la sobreproducción letal de Rgf1p. Estos datos sugieren que Rgf1p actúa por debajo de Wsc1p, aunque no dicen si lo hace directa o indirectamente.⁽⁴⁾Además Rgf1p también ha sido relacionada con la progresión normal del ciclo celular y la tolerancia al estrés crónico de la célula.⁽¹⁷⁾Recientemente se describió su participación en la vía de señalización de reparación de la rotura de la doble cadena de ADN (DBS) en la levadura de fisión.⁽¹⁸⁾

La sobreexpresión de Wsc1p aumenta los niveles de Rho1p y también aumenta la cantidad de pared celular, lo que es un estrés para la célula y podría actuar activando la cascada indirectamente. Aun así y puesto que los "sensores" comparten una función esencial en lo que respecta a la integridad celular, se pudiera pensar que solo la ausencia de los dos a la vez debería tener un efecto en la transmisión de la señal.^(4,9)Wsc1p también tiene un papel importante en la respuesta a diferentes estreses químicos, iones metálicos y en la adaptación estacional al medio ambiente.⁽¹⁹⁾

En Saccharomyces cereviciae se ha descrito que Wsc1p utiliza su dominio citoplásmico para interaccionar con el GEF de Rho1p, Rom2p, lo que sugiere que la interacción de Wsc1p con Rom2 facilita la activación de Rho1p.⁽²⁰⁾

Se concluye que el Wsc1p colocaliza con Rgf1p-Tomato sobre todo en los polos y en el septo, mientras que en el mutante wsc1Δ rgf1Δ Rgf1p-GFP, Rgf1p se localiza normalmente en los polos y en el septo, de la misma forma que lo hace en la cepa silvestre; pero la deleción simultánea de los genes wsc1+ y rgf1+ es letal.

La sobreexpresión de Rgf1p no es letal en el mutante wsc1Δ mientras que la sobreexpresión de wsc1⁺ aumenta los niveles de fosforilación de Pmk1p, este aumento depende del módulo de MAP kinasas ya que no se produce en el mutante mhk1Δ y depende solo parcialmente de Rgf1p. La sobreexpresión de Wsc1p aumenta la cantidad de pared celular, lo que es un estrés para la célula y podría actuar activando la cascada de integridad celular parcialmente, a través de Rgf1p.

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Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Contribuciones de los autores

Sandra Margarita Cruz Quintana: conceptualización; metodología; redacción-borrador original.

Pedro Díaz Sjostrom: Curación de datos; análisis formal; redacción-revisión y edición.

Michel Leiva Mora: Curación de datos; análisis formal; redacción-revisión y edición.

Oscar Patricio Núñez Torres: Curación de datos; redacción-revisión y edición.

Financiación

Título del proyecto: Los reguladores de la GTPasa Rholp y el control de la polaridad, la integridad y la citocinesis en Schizosaccharomyces pombe.

Entidad financiadora: CICYT (BFU2008-00963/BMC).

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