Métodos in vitro fisicoquímicos para el control de calidad de vacunas: vacuna contra la rabia, una historia exitosa

ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Métodos in vitro fisicoquímicos para el control de calidad de vacunas: vacuna contra la rabia, una historia exitosa

 

In vitro or physicochemical methods for quality control of vaccines: rabies vaccination, a success story

 

 

Laura Sánchez Céspedes,I Luis Jiménez HerreraII

I Instituto Clodomiro Picado, Universidad de Costa. San José, Costa Rica.
II Facultad Farmacia, Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica.

 

 


RESUMEN

El control de calidad de las vacunas es una parte fundamental en el proceso de producción y liberación de los lotes, tanto para determinar su efectividad como su seguridad. Tradicionalmente, en esta labor se utilizan pruebas in vivo que conllevan el uso extensivo de animales de laboratorio. En la vacuna de la rabia, la potencia se determina mediante la prueba desarrollada por Instituto de Salud de los Estados Unidos, en la que los animales son retados con diferentes cantidades de toxinas mientras que la prueba de seguridad se realiza al inyectar la vacuna en el cerebro de ratones recién nacidos, lo cual ha sido éticamente cuestionable. Las agencias reguladoras y los laboratorios productores trabajan en el desarrollo de nuevos métodos que permitan reemplazar o disminuir la cantidad de animales utilizados en estas pruebas; sin embargo, se requiere la homogenización y validación de los métodos in vitro desarrollados, para que estos puedan reemplazar los métodos in vivo tradicionales.

Palabras clave: control de calidad; vacuna; prueba in vivo; rabia; prueba in vitro.


ABSTRACT

Quality control of vaccines is a key part in the batch production and release process, both for effectiveness and safety testing. Traditionally, in vivo tests involving extensive use of laboratory animals are used. For the rabies vaccine, potency is determined by the NIH test in which the animals are challenged with different amounts of toxins while the safety test is performed by injecting the vaccine into the brains of suckling mice, which has been ethically questionable. Regulatory agencies and producers are working on the development of new methods to replace or reduce the number of animals used in these tests; however, the homogenization and validation of in vitro methods developed are required so that they can replace traditional in vivo methods.

Keywords: Quality control; vaccine; in vivo test, rabies; in vitro test.


 

 

INTRODUCCIÓN

Las técnicas tradicionales que se utilizan en el mundo por los laboratorios productores en el control de calidad de vacunas para uso humano y uso veterinario implican el uso extenso de animales de laboratorio, lo que aumenta el costo y la complejidad de las mismas, además de ser éticamente cuestionables por el daño que causan en estos.1-4 A pesar de esto, las agencias reguladoras solicitan que los ensayos de potencia y seguridad para la liberación de lotes de vacunas, por lo general, se realicen en animales y frecuentemente mediante pruebas de neutralización de toxinas, retos de inmunización, pirógenos y ausencia de toxicidad.5-12 Este tipo de ensayo de forma ordinaria, involucra pruebas que causan dolor, estrés e inclusive la muerte en los animales; ya que se utilizan aspectos como letalidad o signos y síntomas clínicos notables como punto final de las pruebas.2 En adición, las pruebas in vivo son caras, demandan mucho tiempo y conllevan una variabilidad alta y repetibilidad pobre debido a diferencias individuales de los animales y condiciones ambientales entre otros.1-3,7

Por lo anterior, desde mediados del siglo pasado la comunidad científica y algunas agencias reguladoras han enfatizado en la necesidad de aplicar el concepto de las "3 R's", con el que se expone la importancia de refinar, reducir y reemplazar el uso de animales en las pruebas realizadas a medicamentos; tanto durante la etapa de desarrollo y de estudios clínicos, como en el control de calidad de rutina durante la producción.2,3,7,13-17 El desarrollo de métodos alternativos que logren el reemplazo total de los métodos tradicionales es una tarea laboriosay específica para cada vacuna, lo que implica una comprensión profunda del mecanismo de la vacuna para generar inmunidad o de los agentes contaminantes, así como también de los esfuerzos para lograr la correlación entre las pruebas in vitro fisico-químicas y las pruebas in vivo, labor que no siempre es fructífera.2,7,18 Es por estas razones que el proceso de reemplazo de métodos in vivo por métodos in vitro avanza a paso lento.

En el presente trabajo se expone el caso de la vacuna inactivada contra la rabia, parala cual se han logrado desarrollar pruebas in vitro o fisico-químicas que demuestran que pueden ser utilizadas para el reemplazo de las pruebas in vivo. La rabia es una enfermedad transmitida por un virus, el cual puede infectar a todos los mamíferos, en los cuales se afecta el Sistema Nervioso Central (SNC)19-20 y que no tiene un tratamiento efectivo; por eso debe ser prevenida tanto pre y post-exposición mediante el uso de una vacuna.7,20-21 La vacuna pre-exposición está compuesta por virus vivos inactivados, de modo que, para la liberación de los lotes y su comercialización, es imprescindible que se verifique su potencia y su seguridad.7,11,20-26

Para la realización de la presente revisión se consultaron artículos de las revistas científicas que se acceden a través de las bases de datos a las cuales está inscrita la Universidad de Costa Rica, entre ellas ScienceDirect, Embase, Elsevier, Springer y otras. Adicionalmente se revisaron documentos oficiales emitidos por la WHO, la FDA y la EMEA; así como las farmacopeas británica, estadounidense, europea y japonesa.


PRUEBA DE POTENCIA

La determinación de la potencia de la vacuna inactivada contra la rabia se realiza mediante la prueba conocida como "NIH test", la cual fue desarrollada por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH por sus siglas en inglés) en 1953 y que consiste en la vacunación de grupos de ratones en dos ocasiones y separadas por siete días. Una semana después del último refuerzo se debe retar a los animales con una inyección intracerebral de una cantidad de virus estándar para pruebas que corresponda al menos, a 5DL50. Los animales son observados posteriormente por 14 días para calcular la dosis eficaz 50 de la vacuna (ED50).11,23-26 Sin embargo, al tratarse de una prueba de reto, es considerada una prueba controversial que no siempre es confiable, debido principalmente a la gran variabilidad de sus resultados;27 esas críticas han motivado a investigadores a buscar métodos alternativos para el reemplazo de esta prueba.

En 1981, Barth et al28 describió una modificación para el ensayo de unión de anticuerpos que puede ser utilizada para el reemplazo de la prueba del NIH. Durante el ensayo se prepara un suero anti-rabia en conejos y se le agrega antígeno inactivado del virus de la rabia, el cual es producido en un sistema de fibroblastos de embrión de pollo para determinar el grado de unión a los anticuerpos del suero. En este caso, la lectura de la cantidad de antígeno neutralizado por los anticuerpos es medido por medio de una reacción de fluorescencia. Así se logra demostrar que el ensayo de unión de anticuerpos, brinda resultados más reproducibles que la prueba de NIH; sin embargo, se recomienda como un método de control en proceso y no para la liberación de lotes de vacuna.28

Luego, en 1984, se realizó un estudio colaborativo interlaboratorial acerca del uso de un ensayo de inmunodifusión radial sencillo, con la intención de determinar la cantidad de glicoproteína del virus de la rabia, que es considerada como el antígeno que ofrece mayor protección contra el virus. Con el ensayo se cuantificó la glicoproteína del virus de la rabia presente en una preparación mediante el cálculo del área de la zona de difusión en un gel de agarosa de los antígenos hacia los anticuerpos específicos. Este método es reproducible, sencillo y rápido; se recomienda su uso como un complemento al método in vivo ya aprobado, ya que no puede ser utilizado en vacunas con poco contenido de antígeno, con altas concentraciones de contaminantes o en en las cuales el antígeno está adsorbido en hidróxido de aluminio.29

A partir de la década de los 90, se ha trabajado en el desarrollo y estandarización de varios métodos de ensayo que implican el uso de la técnica de ELISA.22,30-32 El primer estudio realizado en 1989 utilizó un suero anti-rabia policlonal para la cuantificación de la glicoproteína de virus de la rabia, el cual es un método que puede ser un suplemento para la prueba in vivo del NIH.30 También, en 1990, Perrin et al27 comprobaron que el método por ELISA que utiliza anticuerpos monoclonales anti-glicoproteína de rabia para la detección de este antígeno era un buena opción para el reemplazo del método del NIH;31con todo, el método in vivo continúa siendo el aprobado para la liberación de los lotes de vacuna inactivada contra el virus de la rabia. Por último, en 2013 se desarrolló un ELISA para la cuantificación mediante el anticuerpo MAb D1 de un epitopo de la glicoproteína del virus de la rabia inmunodominante,que induce la respuesta inmune y al mismo tiempo está relacionado con la neurovirulencia y patogenicidad.22 Este ELISA ha demostrado ser lo suficientemente reproducible y confiable, por lo que parece ser una herramienta prometedora para la sustitución del método del NIH.22

Así también se cuenta con el empleo de nuevas tecnologías para el desarrollo de métodos de análisis inmunoquímicos. De modo que Smith et al33 puntualizaron un nuevo método para el análisis de contenido de glicoproteína del virus de la rabia en vacunas antirábicas. Este método utiliza un ensayo de captura de antígeno en una plataforma "meso scale Discovery" (MSD) para determinar la electroquimioluminiscensia (ECL) del complejo antígeno-anticuerpo. El ensayo de electroquimioluminiscencia se basa en el acercamiento de un marcador sulfonado a una corriente eléctrica en la superficie de la plataforma, lo que resulta en una emisión de luz que puede ser medida. En el análisis de los resultados de este estudio, se comprobó que este método posee las mismas ventajas y desventajas que los métodos desarrollados a través del uso de la técnica de ELISA; no obstante, este método es más eficiente, más sensible y con menos ruido de fondo, aunque es más costoso. Los autores de este estudio concluyeron que este ensayo se puede convertir en un método para determinar si una vacuna pasa o falla la prueba de potencia en lugar de cuantificar la cantidad de antígeno.33


PRUEBAS DE SEGURIDAD Y DETERMINACIÓN DEVIRUS VIVOS RESIDUALES EN LA VACUNA

La inactivación del virus es una etapa crucial en la producción de la vacuna contra de la rabia, y esta etapa se puede realizar por diversos métodos, comopor ejemplo la adición de β-propiolactona, fenol, N-tributilfosfato, formalina o radiación ultravioleta.6,26,34 La reversión en la inactivación del virus o la presencia de virus vivos residuales pueden causar problemas de seguridad en la vacuna como los dos casos que se han reportado: el primero en Fortaleza, Brasil, en 1960, en el cual 18 personas murieron infectadas por el virus de la rabia post-vacunación;34 el segundo, ocurrido en el 2004, sucedió cuando la FDA emitió una alerta de seguridad en la cual informó que la empresa Aventis Pasteur hacía el retiro voluntario de 4 lotes de vacuna IMOVAX al encontrarse la presencia de una cepa del virus de la rabia que no había sido inactivada en otro lote producido en la misma época.36 Estos casos expuestos anteriormente refuerzan la importancia de la comprobación de la inactivación del virus de la rabia en cada lote de vacuna producido antes de su liberación y comercialización; así como la ausencia de otros virus o contaminantes que puedan ser considerados como posibles problemas de seguridad.

En la actualidad, varias agencias reguladoras utilizan un método en el cual la vacuna a granel se prueba en ratones lactantes para la determinación de la presencia de virus vivos y la seguridad de los lotes de la vacuna. En este método, diez o más ratones recién nacidos son inoculados con la vacuna de manera intracerebral y los animales son observados por 21 días para determinar su supervivencia y la ausencia de síntomas de enfermedad. Si durante la prueba algún animal muere, esta debe ser repetida para la confirmación del resultado.11,25-26,37

En 1971, Mitchell et al, detallaron un método mediante el cual los virus viables residuales, presentes en la vacuna de rabia inactivada, eran replicados y amplificados mediante un cultivo celular y posteriormente se inyectaban a ratones.38 En este método, la vacuna se replica en un cultivo de células primarias de riñón de hámster durante 14 días; posteriormente, muestras de estos cultivos se inoculan en ratones para determinar la presencia de los virus vivos.38

Empero, Organización Mundial de la Saludla (OMS) y la farmacopea británica brindan la posibilidad de realizar el ensayo para la comprobación de la inactivación del virus de la rabia en la vacuna mediante un método in vitro. Este método consiste en una prueba de amplificación del virus después de la inactivación, donde una cantidad de suspensión de virus inactivado equivalente a no menos de veinticinco dosis humanas de vacuna se inocula en un cultivo de células del mismo tipo utilizado en la producción de la vacuna; después de 21 días, el cultivo celular debe ser examinado para determinar la presencia del virus de la rabia mediante un método de inmunofluorescencia.23,26

En 2014, Takayama-Ito et al, diseñaron un método in vitro más sencillo y rápido que el método expuesto precedentemente y es recomendado por la OMS y la farmacopea europea.6 En este método, la vacuna debe ser inoculada en un cultivo celular de células tipo Neuro-2a, las cuales son muy sensibles al virus. Este cultivo se incuba a 35 °C por 72 h y se hace un recultivo con las mismas condiciones anteriores, para subsiguientementeser sometido a un ensayo de inmunofluorescencia. Entre las ventajas que presenta este ensayo frente al actualmente aceptado y expuesto anteriormente, es la duración, ya que este ensayo toma solamente seis días en comparación con los 14 días de duración del método tradicional. Adicionalmente, se demuestra que este método es más sensible que el método actual.6


EXPECTATIVAS MUNDIALES EN LA DISMINUCIÓN DE USO DE ANIMALES EN LAS PRUEBAS DE CONTROL DE CALIDAD DE VACUNAS

Como se ha expuesto, existen varias opciones de métodos alternativos a los métodos in vivo tradicionales para el control de calidad de la vacuna de la rabia, específicamente para la prueba de potencia y la prueba de seguridad e inactivación del virus de la rabia. Paralelo a este desarrollo de nuevos métodos, en el mundo se fomenta la aplicación de la filosofía de las 3 R en el uso de animales para el control de calidad de vacunas: reducción, refinamiento y reemplazo de las pruebas en animales.2,3,7,14,15,26,39

En esta dirección, el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) ofrece una serie de recomendaciones para aplicar el método de las 3R's en el control de calidad de la vacuna de la rabia. Como parte de las recomendaciones emitidas en cuanto a la prueba de potencia, el ECVAM sugiere implementar un enfoque de consistencia en la producción de las vacunas que permitan la fabricación de productos consistentes y con características físico-químicas conocidas que favorezcan la utilización de un solo nivel de dilución en la prueba NIH, lo que reduciría la cantidad de animales utilizados; además, se sugiere refinar la prueba de NIH buscando nuevas vías de inyección, utilizando anestésicos o utilizando puntos finales intermedios que no impliquen la muerte del animal.39 En complemento, se respalda que las agencias reguladoras deben facilitar la realización de estudios interlaboratoriales que permitan la evaluación de los métodos in vitro candidatos a la sustitución del método NIH; así como recomiendan no utilizar este último como estándar de comparación debido a la variabilidad que conlleva el método per se.39

En cuanto a las recomendaciones para la reducción, refinamiento y el reemplazo de las pruebas de seguridad, el ECVAM alude que se debe aclarar y armonizar en las farmacopeas nacionales y europea que se utilice el método de cultivo celular detectado con inmunofluorescencia y que se elimine el uso de ratones para la detección del punto final de la prueba.39

A pesar de los esfuerzos que realizan grupos como el ECVAM, en la actualidad todavía se considera que aproximadamente el 70 % de los animales utilizados con propósitos relacionados con vacunas se utilizan en el control de calidad para la liberación de lotes.40

En 2014, en un estudio se analizaron los motivos que pueden limitar la disminución del uso de animales o el reemplazo de los mismos en la prueba de NIH y la aceptación de estos métodos tanto en los productores como en las agencias reguladoras.40 Dentro de las barreras que debe enfrentar esta teoría para el reemplazo de esta prueba se citan el miedo de liberar vacunas con baja potencia, las limitaciones técnicas en la implementación y validación de nuevos métodos, el considerar la prueba de NIH como un estándar de oro y la falta de armonización en los requisitos regulatorios entre las diferentes agencias mundiales. Se propone que la única manera de derrumbar estas barreras es mediante el fomento del trabajo en equipo entre los productores y las agencias reguladoras, así como conseguir la armonización de los requisitos y el entendimiento profundo de los nuevos métodos.40

En conclusión, el desarrollo de métodos de control de calidad de vacunas alternativos para el reemplazo de los métodos tradicionales que emplean animales es un proceso laborioso. A pesar de eso, la vacuna de la rabia es un ejemplo de la posibilidad de disponer de métodos iguales o más sensibles y consistentes que los métodos in vivo.

La prueba de potencia NIH, establecida por las agencias reguladoras y farmacopeas oficiales, puede ser reemplazada por técnicas como fluorescencia, inmunodifusión radial y electroquimioluminiscencia; y el método más prometedor es el método por ELISA, para el cual se desarrolló un método que cuantifica un epitopoinmunodominante de la glicoproteína del virus de la rabia que induce la respuesta inmune y se relaciona con la patogenia de la enfermedad. Para el reemplazo de la NIH por pruebas novedosas, se hace necesario la comprobaciónde la validez y su comparabilidad con la misma.

Tradicionalmente la prueba de seguridad e inactivación del virus se basa en la inyección de la vacuna de manera intracerebral en ratones recién nacidos. Los nuevos métodos que determinan la inactivación miden la toxicidad de la vacuna en cultivos celulares sensibles al virus, los cuales han sido aceptados por varias agencias reguladoras y farmacopeas oficiales como la forma oficial de comprobación de la seguridad.

A pesar de los esfuerzos para desarrollar métodos de reemplazo de las pruebas in vivo por pruebas in vitro, existe desconfianza hacia las pruebas in vitro en que puedan permitir la liberación de lotes de vacuna con baja potencia o que causen problemas de seguridad, así como que la correlación con las pruebas in vivo no es la esperada. Esa co-relación no es sencilla de establecer, debido, en especia,l a la variabilidad intrínseca presente en las pruebas biológicas. Es por esto que las agencias reguladoras y de fabricantes deben trabajar en conjunto, para dar a conocer los avances que se desarrollen en el tema y colaborar en la reducción de las barreras y mitos que se puedan hallar en la implementación de nuevos métodos que favorezcan la disminución del uso de animales en las pruebas de laboratorio.

 

Conflictos de intereses

Los autores declaran no presentar conflicto de intereses.

 

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Recibido: 5 de agosto de 2016.
Aprobado: 5 de noviembre de 2016.

 

 

Luis Jiménez Herrera. Facultad Farmacia, Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica.
Dirección electrónica: lgjhfa@gmail.com

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