ARTÍCULO ORIGINAL

 

Extractos del Caribe Colombiano con actividad antiproliferativa frente a líneas celulares de cáncer de pulmón

 

Colombian Caribbean extracts with anti-proliferative activity against lung cancer cell lines

 

 

Daneiva del Carmen Caro Fuentes¹ http://orcid.org/0000-0001-8079-5664
Yanet Cecilia Ocampo Buendía1 http://orcid.org/0000-0003-2001-3848
Laura Cristina Ospina Mateus¹
Rubén Darío Salas Díaz¹ http://orcid.org/0000-0003-0583-7304
Fredyc Díaz Castillo² http://orcid.org/0000-0002-2512-8313
Luis Alberto Franco Ospina¹ http://orcid.org/0000-0003-2983-0836

¹Universidad de Cartagena, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Grupo de Evaluación Biológica de Sustancias Promisorias, Carrera 50 No. 24-63. Cartagena, Colombia.
²Universidad de Cartagena, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Laboratorio de Investigaciones Fitoquímicas y Farmacológicas (LIFFUC). Cartagena, Colombia.

 

 

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RESUMEN

Introducción: El cáncer de pulmón es uno de los tipos de cáncer con mayor impacto sobre la población. Debido a las limitaciones de las terapias convencionales tales como su poca selectividad, las reacciones adversas y la resistencia que tiene, se hace necesaria la búsqueda de nuevos metabolitos activos, tomando a las plantas medicinales como fuentes promisorias a explorar.
Objetivo: Evaluar la actividad anti-proliferativa de 15 extractos vegetales obtenidos de plantas medicinales del Caribe Colombiano, frente a las líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y H292.
Métodos: La actividad biológica de los extractos etanólicos totales se evaluó mediante el empleo del método colorimétrico de reducción del MTT y el ensayo de clonogenicidad. Como primer paso, se determinó la viabilidad celular y se calculó la CI₅₀. Para los extractos activos, se evaluó posteriormente el efecto sobre la formación de colonias en células H292, la cual fue la línea celular más sensible al efecto de los extractos.
Resultados: Los extractos de C. malambo, C. odoratissima, M. charantia, T. cymosa, T. hirta y T. peruviana inhibieron significativamente la viabilidad (CI₅₀< 100 μg/mL) y la capacidad de formación de colonias de las células de cáncer de pulmón. T. cymosa, T. hirta y T. peruviana. Se destacaron como las especies más activas.
Conclusiones: De los 15 extractos evaluados, seis presentan un efecto antiproliferativo en las líneas celulares de cáncer pulmonar. Por tanto, estas especies vegetales del Caribe Colombiano constituyen una fuente promisoria de metabolitos secundarios activos potencialmente útiles para el tratamiento del cáncer de pulmón, patología que presenta elevadas tasas de incidencia, prevalencia y mortalidad a nivel mundial.

Palabras clave: supervivencia celular; extractos vegetales; neoplasias pulmonares; línea celular.

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ABSTRACT

Introduction: Lung cancer is a type of cancer with high impact on the population. Due to limitations on conventional therapies (low selectivity, secondary effects and resistance), it is necessary to focus scientific research on the search of new active metabolites, with medicinal plants as a promising source to explore.
Objective: To evaluate the anti-proliferative activity of 15 plant extracts obtained from medicinal plants from the Colombian Caribbean against lung cancer cell lines (A549 and H292)
Methods: The biological activity of the total ethanolic extracts was evaluated with the MTT reduction colorimetric method and clonogenic assay. Firstly, the cell viability was determined and the IC₅₀ calculated, later the effect of the extracts on the colony formation was evaluated on H292 cells, which was the cell line most susceptible to the treatment with the extracts.
Results: The extracts of C. malambo, C. odoratissima, M. charantia, T. cymosa, T. hirta and T. peruviana significantly inhibited the cell viability (IC₅₀< 100 μg/mL) and the formation of lung cancer cell colonies, with T. cymosa, T. hirta and T. peruviana being highlighted as the most active species
Conclusions: The anti-proliferative effect of extracts obtained from six plant species of the Colombian Caribbean coast was evidenced, which are constitute a promising source of secundary metabolites potentially useful for treatment of lung cancer, pathology with high rates of incidence, prevalence and mortality worldwide.

Keywords: cell survival; plant extracts; lung neoplasms; cell line.

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INTRODUCCIÓN

El cáncer es una patología que involucra un proceso de crecimiento tisular y proliferación continua de células anormales con capacidad de invasión y destrucción de otros tejidos, que puede iniciarse en cualquier lugar del cuerpo humano.¹

En el año 2012, se presentaron 14 millones de casos y en 2015 ocurrieron 8,8 millones de defunciones atribuidas a este diagnóstico, cuya causa de mortalidad ocupa el segundo lugar después de las enfermedades cardiovasculares.¹ En cuanto a las tipologías, el cáncer de pulmón ocasiona el mayor número de muertes (1,69 millones de defunciones en 2015) y se clasifica como enfermedad de mal pronóstico con tasas de supervivencia relativa muy bajas, en comparación con otros tipos de cáncer.¹

Colombia no está exenta de esta problemática y, de acuerdo a lo reportado por el Observatorio Nacional de Cáncer (ONC Colombia), este grave problema de salud pública cobra la vida del 12,3 % de los pacientes diagnosticados con cáncer cada año.² Entre las principales alternativas disponibles para el tratamiento del cáncer de pulmón se encuentran la cirugía, la radioterapia y quimioterapia, las cuales disminuyen los signos y síntomas de la enfermedad y prolongan la vida de los pacientes. Sin embargo, la adherencia a la quimioterapia -por lo general- es baja debido a la elevada toxicidad y a la poca selectividad de los fármacos utilizados, que no solo afectan el crecimiento y propagación de las células cancerosas, sino también el de las células normales, con consecuentes efectos secundarios que deterioran la calidad de vida del paciente. Adicionalmente, es frecuente la presencia de células cancerosas resistentes al tratamiento. Esta conduce al aumento de la dosificación y al incremento consecuente de la frecuencia y severidad de los eventos adversos, los cuales afectan negativamente la relación riesgo-beneficio del tratamiento.^3,4

Esta problemática mantiene constante la búsqueda de nuevas alternativas para el tratamiento de esta patología, en donde los productos naturales representan una de las principales fuentes de nuevos agentes, más potentes y con menores efectos adversos, que permitan combatir esta afección de alto impacto social y económico. Entre estos, las plantas medicinales han sido la base para muchos tratamientos farmacológicos y continúan siendo una de las opciones más populares para la prevención del cáncer a nivel global.^5,6

Colombia se encuentra catalogado entre los países considerados megadiversos. Sin embargo, un elevado porcentaje de las especies existentes no han sido estudiadas, por lo que existe una alta probabilidad de encontrar en ellas metabolitos potencialmente activos para la prevención y/o tratamiento del cáncer.⁷

En este trabajo, se propuso evaluar la actividad antiproliferativa de 15 extractos vegetales obtenidos de plantas medicinales del Caribe Colombiano, frente a dos líneas celulares de cáncer de pulmón: NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide) y A549 (adenocarcinoma pulmonar), al utilizar el método colorimétrico de reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y el ensayo de clonogenicidad.

 

MÉTODOS

MATERIAL VEGETAL Y PREPARACIÓN DE EXTRACTOS

El material vegetal fue recolectado en diferentes municipios de la Costa Caribe Colombiana. Muestras testigos de las 15 especies vegetales se depositaron en las colecciones del Jardín Botánico "Guillermo Piñeres", de la ciudad de Cartagena (JBC) y en el Herbario Nacional Colombiano (COL). (tabla 1)

El material vegetal se secó a temperatura ambiente, se pesó -reducido a polvo por molienda- y se sometió a maceración en frío con etanol al 96 % hasta agotamiento. El extracto obtenido se filtró y concentró a presión reducida en un rotaevaporador (Heidolph, Alemania). El rendimiento del proceso fue determinado a partir del material vegetal seco.

TAMIZAJE PRELIMINAR FITOQUÍMICO

Con el objeto de identificar los principales metabolitos secundarios presentes en los extractos totales evaluados, se realizaron pruebas para la detección de alcaloides, cumarinas, taninos, glicósidos cardiotónicos, flavonoides, saponinas, triterpenos, esteroles y quinonas. Se utilizó la metodología validada por Herrera y otros.⁸

CULTIVOS CELULARES

El efecto antiproliferativo de los extractos totales de las especies en estudio, se evalúo frente a las líneas celulares de carcinoma pulmonar H292 (CRL-1848TM) y A549 (CCL-185TM), obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se mantuvieron en medio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium), suplementado con 10 % de suero bovino fetal, e incubadas a 37 °C, atmosfera al 5 % CO₂ y humedad relativa del 100 %.

ACTIVIDAD CITOTÓXICA

Las células se cultivaron en placas de 96 pozos estériles por 24 horas y se trataron con diluciones seriadas de los extractos totales en estudio (0-100 mg/mL), fueron disueltas en dimetilsulfóxido (DMSO), etanol o mezclas de estos solventes (tabla 1), e incubadas durante 48 horas. La inhibición del crecimiento celular se evaluó mediante el empleo del método colorimétrico, descrito por Mosmann en 1983.⁹ Este se basa en la determinación de la reducción por células metabólicamente activas del MTT (amarillo) a cristales de formazán (púrpura) midiendo la absorbancia a 550 nm. Cada ensayo se realizó por triplicado y en cada uno se incluyó un grupo control de células tratadas con el solvente. Para cada extracto se calculó el porcentaje relativo de supervivencia con respecto al grupo control, y posteriormente, se calculó la concentración inhibitoria 50 (CI₅₀, concentración del extracto que inhibe el crecimiento del 50 % de la población celular), para aquellos extractos que mostraron promisoria actividad biológica (CI₅₀< 100 µg/mL). Posteriormente los extractos se clasificaron según criterios del National Cancer Institute (NCI), el cual, cataloga las sustancias experimentales como Activas (++): CI₅₀< 20 µg/mL, Moderadamente activas (+): 20< CI₅₀ < 100 µg/mL e Inactivas (-): CI₅₀> 100 µg/mL.¹⁰

ENSAYO DE CLONOGENICIDAD

Al tener en cuenta los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad citotóxica, se evaluó el efecto de los extractos sobre la capacidad de división y formación de colonias sobre la línea celular más sensible a un mayor número de extractos. Las células se sembraron en placas de seis pozos (500 células/ pozo), lo que permitió su adhesión por un periodo de cuatro horas. Luego de ese tiempo, se trataron con los extractos activos en estudio (CI₅₀) por un periodo de 48 horas, luego del cual se retiró el agente citotóxico y se incubaron nuevamente por un periodo de 10 días para permitir la formación de colonias.

Finalmente, las colonias se fijaron, teñidas con cristal violeta y contadas mediante el empleo de un estereomicroscopio (Leica EZ4, Wetzlar, Alemania). Se consideró como una colonia a un grupo conformado por mínimo 50 células. Cada ensayo se realizó por duplicado y en cada uno se incluyó un grupo control negativo de células tratadas con el solvente y un grupo control positivo tratado con doxorrubicina.^11,12

 

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados se expresaron como la media aritmética de los valores ± EEM (error estándar de la media), obtenidos de -al menos- dos ensayos independientes (n=4) y se analizaron mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de un test de Dunnett para comparaciones múltiples, con valores de p< 0,05, considerados como significativos. La CI₅₀ se determinó mediante análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración frente al porcentaje de inhibición del crecimiento celular.

 

RESULTADOS

PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS Y TAMIZAJE PRELIMINAR FITOQUÍMICO

En la tabla 1 se presentan los rendimientos de los extractos totales etanólicos obtenidos a partir del material vegetal recolectado, donde se especifica, además, el solvente utilizado para su disolución con fines de utilización en los ensayos biológicos. En cuanto a la identificación de los grupos de metabolitos secundarios presentes en cada uno de los extractos, en la tabla 2 se presentan los resultados de las pruebas de caracterización fitoquímica.

ACTIVIDAD CITOTÓXICA

Los resultados obtenidos de la evaluación de la actividad biológica de los extractos vegetales se presentan en la figura 1 y en la tabla 3, en donde se resalta la actividad mostrada por seis de los extractos evaluados, los cuales exhibieron valores de CI₅₀ inferiores a 100 μg/mL, frente a alguna de las líneas en estudio.

 

La línea celular A549 mostró ser sensible frente a los extractos de T. cymosa, T. peruviana, T. hirta y C. odoratissima, mientras que la línea celular H292 mostró ser sensible frente a un mayor número de extractos vegetales: M. charantia, T. cymosa, T. peruviana, T. hirta y C. malambo.

Se tuvieron en cuenta los valores de CI₅₀, para clasificar los extractos según los criterios del NCI. Los extractos de T. hirta y T. peruviana quedaron catalogados como activos frente a la línea A549 y el extracto de T. hirta fue el único activo frente a la línea H292. En cuanto a los moderadamente activos, se encuentran los extractos de T. cymosa y C. odoratissima frente a A549 y M. charantia, T. cymosa, T. peruviana y C. malambo, frente a H292.

ENSAYO DE CLONOGENICIDAD

La línea epitelial de carcinoma pulmonar H292 fue la más sensible al tratamiento con los extractos, por lo que fue seleccionada para evaluar el efecto de los extractos sobre la formación de colonias. Los resultados obtenidos de esta evaluación se presentan en la figura 2, donde se observa que todos los extractos evaluados a la concentración inhibitoria (CI₅₀) evitaron completamente la formación de colonias, en comparación con el grupo control no tratado. Es importante resaltar que todos los extractos evaluados mostraron una actividad comparable a la mostrada por la doxorrubicina, agente quimioterápico de amplio uso en el tratamiento del cáncer, el cual fue utilizado como control positivo en el ensayo.

 

DISCUSIÓN

Desde tiempos milenarios, las plantas han constituido una fuente de sustancias que mitigan y curan los signos y síntomas de las enfermedades que más aquejan al ser humano.¹³ Su modo de empleo va desde el uso de preparaciones obtenidas de sus diferentes órganos hasta el consumo de compuestos y principios activos aislados a través de diferentes procesos. El potencial terapéutico de este importante recurso natural se empieza a explorar normalmente en zonas rurales, en donde el acceso a medicamentos es limitado, hecho que contrasta con la abundancia de especies vegetales que crecen en esas zonas.

La utilidad de las plantas medicinales ha sido ampliamente demostrada y validada científicamente. De hecho, los fármacos quimioterápicos -vinblastina, vincristina y paclitaxel- utilizados para tratar leucemias, linfomas, cáncer de seno, testículo y pulmón, fueron aislados de las especies vegetales Catharanthus roseus G. Don. y Taxus brevifolia Nutt.^5,14,15

En el presente estudio, se inició la búsqueda de metabolitos bioactivos en especies vegetales de la Costa Caribe Colombiana, zona que posee una gran variedad y cuenta con una tradición ancestral en cuanto al uso de especies vegetales para contrarrestar los signos y síntomas de todo tipo de enfermedades, donde se incluye el cáncer. Entre los principales hallazgos, se destacaron las especies T. hirta, T. peruviana y T. cymosa, por su actividad frente a las dos líneas de cáncer de pulmón. El extracto de las hojas de T. hirta mostró potente actividad frente a estas líneas, con valores de CI₅₀< 20 μg/mL.

Estos resultados son similares a los informados por Hernández y otros, donde la fracción rica en polisacáridos -obtenida del extracto acuoso de las hojas de T. hirta- inhibió significativamente el crecimiento de líneas celulares de origen neoplásico, incluyendo células A549 (CI₅₀≈ 60-120 μg/mL), sin afectar el crecimiento de fibroblastos humanos normales, lo cual es coherente con el uso medicinal dado a T. hirta por pacientes del Hospital Oncológico de Santiago de Cuba, para tratar diferentes tipos de cáncer, donde se incluyó el de pulmón.¹⁶

En otro estudio realizado por el mismo autor, el extracto ya mencionado mostró inhibir el crecimiento de células de cáncer de mama (T-47D) y de melanoma (SK-mel-3),¹⁶ lo que en su conjunto demuestra la utilidad de T. hirta como reservorio de metabolitos con actividad citotóxica selectiva. De manera similar, T. peruviana mostró actividad en ambos tipos de células de cáncer de pulmón, con valores de CI ₅₀< 55 μg/mL. Esta especie vegetal cuenta con estudios de actividad antimicrobiana,¹⁷ antifúngica¹⁸ y antiviral,¹⁹ así como de actividad citotóxica.^20,21 Estos dos últimos estudios demostraron la utilidad del fruto y la semilla de esta especie para el tratamiento del cáncer, donde Ramos-Silva y otros expusieron que el extracto metanólico del fruto de esta especie induce apoptosis y fragmentación del ADN de células cancerígenas e inhibe selectivamente la proliferación de células de cáncer de mama (MCF7), colon (HT-29), próstata (DU 145) y pulmón (NCI-H460), sin afectar el crecimiento de fibroblastos normales humanos (Detroit 548) y células epiteliales de riñón de mono (Vero).

Por otra parte, Cheng y otros realizaron un estudio fitoquímico de las semillas de T. peruviana que condujo al aislamiento de siete glicósidos cardiotónicos con potente actividad frente a células de cáncer de pulmón (P15), páncreas (SW1990) y gástrico (MGC-803), al promover la inducción de apoptosis y arresto del ciclo celular en la fase G2/M. De manera similar a lo reportado por Cheng y otros, Beltrán Villanueva y otros²² evidenciaron la presencia de glicósidos cardiotónicos en las flores de esta especie, lo cual es coherente con los actuales resultados del estudio preliminar fitoquímico. Lo antes dicho muestra la presencia de glicósidos cardiotónicos en este mismo órgano y dichos compuestos -en función de los antecedentes- podrían estar relacionados con la importante actividad citotóxica mostrada por este extracto.

T. cymosa es una planta ampliamente utilizada en la medicina popular de países como Colombia, Venezuela y la Isla de Trinidad, por sus propiedades antivirales, antihelmínticas, anticancerígenas, analgésicas y larvicidas, con algunas de estas actividades demostradas científicamente.^23,24 En lo que respecta al efecto antiproliferativo, citotóxico o anticancerígeno, es posible considerar la presente comunicación científica como la primera de esta actividad, para esta especie en particular. En el aspecto fitoquímico, el género Tabernaemontana ha sido ampliamente estudiado, en específico para la especie T. cymosa y se ha reportado la presencia de alcaloides, compuestos cardiotónicos, flavonoides y derivados antracénicos,²² metabolitos reconocidos por su bioactividad, los cuales en su mayoría también fueron detectados en el actual estudio, conjuntamente con saponinas, triterpenos, esteroides y quinonas.

Por otro lado, los extractos etanólicos de las hojas de M. charantia y la corteza de C. malambo mostraron solo efectos inhibitorios sobre el crecimiento de la línea celular H292. La especie M. charantia, conocida popularmente como balsamina o melón amargo, es empleada en la medicina popular de muchos países por una amplia variedad de propiedades tales como abortivas, antihelmínticas, anticonceptivas, emenagogas, antimaláricas y antigotosas, así como para el tratamiento de la diabetes, cálculos renales, lepra, hemorroides, neumonía, psoriasis, reumatismo, fiebre y sarna.²⁵ Extractos y fracciones obtenidas de su fruto han sido propuestos como alimentos funcionales para la prevención y el tratamiento del cáncer, probablemente por su alto contenido en saponinas. De hecho, la evidencia experimental preclínica demuestra que los extractos acuoso, etanólico y/o metanólico, así como compuestos aislados de esta especie poseen actividad anticancerígena, mediante inducción de apoptosis y alteración del ciclo celular, en un variado grupo de células tumorales, entre las que se incluyen células de adenocarcinoma pulmonar CL1-0 y A549.^26,27 Entre los compuestos aislados de esta especie, charantagenina D, goyaglicosidos-d, charantagenina E, momordicosido K, estigmasta-7,25(27)-dien-3β-ol y MGDG-C18:3-C18:3, han mostrado actividad citotóxica frente a células de cáncer de pulmón A549.

En tanto, C. malambo es utilizada tradicionalmente en forma de cataplasmas, baños, bebidas y emplastos para tratar diferentes trastornos en los que se incluyen afonía, amigdalitis, bronquitis, catarro, heridas, infección umbilical, desmayo, diabetes, diarrea, dolor corporal, dolor de cabeza junto al de encías, estómago, de muelas, de vientre, por golpes, herida umbilical, indigestión, infección dérmica, inflamación local, parto difícil, placenta retenida, resfriados y tos. Entre las partes más utilizadas de esta especie se encuentran la corteza, las hojas y la planta entera.²⁸ De la corteza, se han extraído aceites esenciales que se han caracterizado y se les han atribuido actividad biológica como antioxidante, citotóxico y acaricida^29,30 mientras que, el extracto acuoso obtenido de este mismo órgano posee actividad anti-inflamatoria y antinociceptiva. Algunos compuestos extraídos como los diterpenos tetracíclicos (ent-16β-17α-dihidroxialurano), mostraron actividad citotóxica e inducción de apoptosis en células de carcinoma mamario (MCF-7).^31,32

Finalmente, Capparis odoratissima, es un arbusto ornamental, cuyas hojas son empleadas para tratar afecciones dermatológicas.²² La revisión bibliográfica realizada, muestra solo un reporte de actividad biológica frente al virus del dengue,³³ de tal manera que los resultados expuestos representan uno de los primeros informes investigativos de la actividad biológica de esta planta y, el primero en comunicar el efecto citotóxico de esta especie vegetal.

En conclusión, se evidencia el potencial de las especies vegetales de la Costa Caribe Colombiana, como fuente para la obtención de metabolitos secundarios activos, entre las que se resaltan T. cymosa, T. hirta y T. peruviana, las cuales podrían contribuir al incremento del arsenal terapéutico disponible para el tratamiento del cáncer de pulmón, enfermedad que cada día cobra más vidas en Colombia y a nivel global.

Se sugiere que la actividad antiproliferativa evidenciada en extractos obtenidos de las especies T. cymosa y C. odoratissima, continúen siendo exploradas, a fin aislar e identificar los compuestos activos y elucidar los posibles mecanismos de acción involucrados.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen a Libis López y Kevin Bolaño, por su apoyo técnico en la realización de los experimentos. También agradecen a las fuentes de apoyo financiero: Universidad de Cartagena y Colciencias (Proyecto 591-2013 y Convocatoria 647-2014).

 

Conflicto de interés

Los autores declaran que no presentan conflicto de interés.

 

Contribuciones de los autores

L. Franco, R. Salas y F. Díaz concibieron y diseñaron el estudio. F. Díaz obtuvo los extractos totales de las especies en estudio, mientras D. Caro y L. Ospina realizaron los ensayos de evaluación biológica. D. Caro y Y. Ocampo redactaron el primer borrador del artículo. R. Salas, F. Díaz y L. Franco revisaron el documento final.

 

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Recibido: 03 de enero de 2019.
Aprobado: 15 de febrero de 2019.

 

 

Luis Alberto Franco Ospina
Universidad de Cartagena, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Grupo Evaluación Biológica de Sustancias Promisorias, Carrera 50 No. 24-63, Campus de Zaragocilla, 130 014. Cartagena, Colombia. Teléfono: (57) (5) 6699771, Fax: (57) (5) 6698323.

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